NEB高保真Cas9蛋白在精準(zhǔn)基因編輯中的應(yīng)用與脫靶效應(yīng)控制策略

內(nèi)容簡介：
本文聚焦于CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的核心工具——Cas9核酸酶，重點(diǎn)介紹了NEB開發(fā)的野生型及高保真突變體SpyCas9蛋白（如HiFi Cas9）的特性。文章從Cas9的酶切機(jī)理（HNH與RuvC結(jié)構(gòu)域）入手，詳細(xì)分析了其脫靶（off-target）效應(yīng)的成因，并闡述了通過蛋白質(zhì)工程獲得高保真變體以降低脫靶活性的分子機(jī)制。同時(shí)，本文提供了基于NEB Cas9蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化基因編輯實(shí)驗(yàn)流程，包括sgRNA制備、RNP（ ribonucleoprotein）復(fù)合物遞送、編輯效率檢測(cè)（T7E1 assay、NGS）以及脫靶效應(yīng)評(píng)估方法，為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、安全的基因組修飾提供了全面技術(shù)指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞： CRISPR-Cas9，脫靶效應(yīng)，HiFi Cas9，核糖核蛋白（RNP），基因編輯效率

正文：

CRISPR-Cas9系統(tǒng)以其設(shè)計(jì)簡便、效率高超的優(yōu)勢(shì)，基因功能研究和基因治療領(lǐng)域。該系統(tǒng)的核心效應(yīng)器是Cas9核酸酶，它能在向?qū)NA（sgRNA）的引導(dǎo)下，對(duì)特定的DNA序列進(jìn)行程序性切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB），進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制（NHEJ或HDR），實(shí)現(xiàn)基因敲除或敲入。然而，最初的野生型化膿鏈球菌Cas9（SpyCas9）在應(yīng)用中暴露出一個(gè)顯著問題：脫靶效應(yīng)（Off-target Effects）。即Cas9-sgRNA復(fù)合物可能會(huì)與互補(bǔ)的DNA位點(diǎn)結(jié)合并切割，導(dǎo)致不可預(yù)知的基因組突變，嚴(yán)重威脅實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和臨床應(yīng)用的安全性。因此，開發(fā)兼具高on-target活性和低off-target活性的高保真Cas9變體，成為該領(lǐng)域的技術(shù)攻堅(jiān)焦點(diǎn)。New England Biolabs憑借其在酶學(xué)領(lǐng)域的深厚積淀，推出了系列高性能Cas9產(chǎn)品，為這一挑戰(zhàn)提供了優(yōu)秀的解決方案。

野生型Cas9的脫靶效應(yīng)主要源于其與DNA相互作用的分子機(jī)制。Cas9的DNA識(shí)別與切割由兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域完成：HNH結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割與sgRNA互補(bǔ)的DNA鏈（target strand），而RuvC結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割非互補(bǔ)鏈（non-target strand）。當(dāng)sgRNA與DNA靶位點(diǎn)之間的互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，特別是發(fā)生在PAM遠(yuǎn)端（PAM-distal region）的錯(cuò)配，有時(shí)仍能誘導(dǎo)Cas9發(fā)生構(gòu)象變化，觸發(fā)其切割活性，從而導(dǎo)致脫靶。此外，細(xì)胞內(nèi)核苷酸切除修復(fù)蛋白等因子也可能被招募，間接影響切割特異性。

為了攻克這一難題，NEB通過理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化，對(duì)野生型Cas9進(jìn)行了工程化改造，成功獲得了高保真變體——HiFi Cas9。其設(shè)計(jì)思路主要是引入關(guān)鍵點(diǎn)突變，增加Cas9對(duì)sgRNA-DNA配對(duì)精度的“驗(yàn)證"步驟。這些突變通常位于Cas9與DNA相互作用的界面，例如，通過增強(qiáng)Cas9與DNA骨架的非特異性相互作用的能量屏障，使得只有配對(duì)的sgRNA-DNA雙鏈才能提供足夠的結(jié)合能來觸發(fā)構(gòu)象變化和切割。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)表明，與野生型Cas9相比，HiFi Cas9在維持絕大多數(shù)靶位點(diǎn)高效切割的同時(shí)，能將脫靶事件降低至無法檢測(cè)的水平，且不依賴于特殊的sgRNA設(shè)計(jì)規(guī)則或化學(xué)修飾，大大拓寬了其應(yīng)用范圍。

在實(shí)際操作中，選擇NEB的Cas9蛋白而非質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，具有多重優(yōu)勢(shì)。其一，蛋白直接遞送形成核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物，可瞬時(shí)發(fā)揮作用，極大縮短了細(xì)胞暴露于Cas9的時(shí)間，進(jìn)一步降低了脫靶概率和免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。其二，RNP復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的半衰期較短，編輯窗口可控，提高了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。其三，對(duì)于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型（如原代細(xì)胞、干細(xì)胞），RNP與電轉(zhuǎn)（Electroporation）或脂質(zhì)納米顆粒（LNP）等技術(shù)聯(lián)用，往往能獲得更高的編輯效率。

一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的基于NEB Cas9蛋白的基因編輯實(shí)驗(yàn)流程包括：sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄或化學(xué)合成；將純化的Cas9蛋白與sgRNA按一定化學(xué)計(jì)量比在體外孵育，形成活性RNP復(fù)合物；通過合適的遞送方式（如電轉(zhuǎn)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、顯微注射）將RNP導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞；最后利用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析（T7E1 Assay）、錯(cuò)配切割 assay（TIDE）或下一代測(cè)序（NGS）等方法定量分析編輯效率。對(duì)于脫靶效應(yīng)的評(píng)估，則可采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)（如COSMID、CCTop工具）結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（如GUIDE-seq、Digenome-seq或 targeted deep sequencing）的策略。

總之，NEB的高保真HiFi Cas9蛋白代表了CRISPR-Cas9工具發(fā)展的重要方向。它有效地在on-target活性和off-target效應(yīng)之間取得了最佳平衡，為功能喪失（Loss-of-function）篩選、疾病模型構(gòu)建以及未來臨床級(jí)的基因治療提供了更安全、更精確的基因編輯工具，推動(dòng)了基因組工程向著更高保真度的新時(shí)代邁進(jìn)。在科研單位領(lǐng)域，上海易匯生物充分考慮到科研項(xiàng)目的緊迫性與前瞻性需求，針對(duì)實(shí)驗(yàn)耗材同步推出了現(xiàn)貨供應(yīng)及期貨定制服務(wù)，一舉解決了科研單位長期面臨的 “緊急實(shí)驗(yàn)缺耗材、長期需求難規(guī)劃" 的棘手痛點(diǎn)。易匯生物的產(chǎn)品運(yùn)營團(tuán)隊(duì)透露，當(dāng)下熱門的細(xì)胞培養(yǎng)皿、PCR 八聯(lián)管等實(shí)驗(yàn)耗材，均有充足現(xiàn)貨儲(chǔ)備，可實(shí)現(xiàn)當(dāng)日下單、次日送達(dá)，確保科研進(jìn)程無縫銜接；而對(duì)于定制化的試劑、特殊規(guī)格的耗材等期貨服務(wù)，易匯生物憑借專業(yè)的研發(fā)生產(chǎn)能力，能夠依據(jù)科研項(xiàng)目周期提前 30 至 60 天鎖定產(chǎn)能，從源頭保障實(shí)驗(yàn)進(jìn)度有條不紊地推進(jìn) 。